周恩来早年立志救国，在中学时期就开始注意军事问题。他在天津时和同学们发起成立敬业乐群会，当时就曾经在会中设立“军事研究团”。他发起组织国防演说会，请人讲“军舰——炮台——陆路”，引导青年学习军事知识。旅欧时期，他领导的中共旅欧支部中专门设立了军事部，这是当时中共中央和其他地方党组织都没有的。他很赞成德国革命家卢森堡提出的“我们要无军队，便不能革命”的主张，认为“这都是见到之语”。1922年，他发表《评胡适的‘努力’》一文，批判胡适所谓建立“好人政府”的主张，认为“都是些不落实际的废话”，在中国，“以为在世界帝国主义和军阀的支配下，便可建立‘好人政府’实现其政治主张，这不是做梦么？”他说：“若徒以手枪、炸弹、罢工、罢市来恐吓，则手枪、炸弹他有躲避之法，罢工、罢市他更可以军队来压迫。”他明确指出：“真正革命非要有极坚强极有组织的革命军不可，没有革命军，军阀是打不倒的。”
1924年7月下旬，周恩来回国，9月初到广州。这时正是商团叛乱的时候，革命军击溃商团军，周恩来参加了临时军事指挥部的工作。随后，他出任黄埔军校教官，11月任黄埔军校政治部主任；同时又是中共广东区委常委兼军事部部长。
黄埔军校区别于旧军校的一个显著特点，就是设有党代表和政治部。军校的一切命令，都必须由党代表副署交校长执行，未经党代表副署无效。政治部负责军校的政治思想教育工作，政治部主任是党代表的参谋长，是相当重要的。但是初期的政治部工作闲淡，形同虚设。在中国军事史上具有开创意义的军队政治工作的建立，是由周恩来在黄埔军校开始的。
周恩来到职后，健全政治工作制度和建立日常的工作秩序，设立指导、编篆、秘书三股，选员任职，重新制定政治教育计划，加授“社会进化史”、“帝国主义侵略中国史”等课程，主要是讲授中国怎样受帝国主义列强的压迫，中国的农工商备界怎样受封建军阀的压迫以及解脱的途径及办法。他建立和健全共产党与青年团组织，成立了中共黄埔军校特别支部，发动党团员和进步青年开展工作。他提出了军队政治工作的方针、方法和目的，指出：“政治工作就是使军阀军队渐渐觉悟，革命军队确实具有革命观念”，“革命军的行动要依着党的政策”，以公开讲演，找士兵个别谈话等方式，“使官佐士兵及一切群众晓得党的理沦、主义、政策”。周恩来平易近人，联系群众，经常在军校内的大榕树下同学员们促膝谈心。学员们思想觉悟迅速提高，军校出现了生动活泼的局面。
黄埔军校第一期学生毕业后，以他们为骨干组建两个教导团，每团约1000多人，编制采三三制。每连有9名军官，一半左右是共产党员。这支以共产党员为核心的部队，在统一广东革命根据地的历次战役中，成为革命军中一支劲旅。这时，周恩来把平时的政治教育转变为战时政治工作，在实践中逐步创立一套新型的军队政治工作。后来毛泽东说：“那时军队设立了党代表和政治部，这种制度是中国历史上没有的，靠了这种制度使军队一新其耳目。1927年以后的红军以至今日的八路军，是继承了这种制度而加以发展的。”朱德也说：“研究党的军史时，应当从这个老根上研究起。”
周恩来解决了建立革命军队的一系列重大理论问题。关于建军的宗旨与任务，他指出：孙中山设军校是要建立“为人民所用之军队”，“军队之打仗是为人民而打的”。革命军队的任务，“是实现我们理论的先锋”。关于军队和党的关系，他指出：“革命军是党的军队，革命军的行动要依着党的政策”，革命军队“是为主义为党国而奋斗的”。关于政治思想工作，他指出：“部队政工是革命的灵魂”。“我们做政治工作的使命，对于官长官佐要巩固其革命观念。对于士兵要使之有革命常识，所以我们要认识革命化、纪律化、统一化。就系统方面说，政治部是军队组织里面的一部分，要辅助各部处的工作，以进行政治教育实施的目的。”对于军队同人民的关系，他指出：革命军队必须同人民紧密团结，革命军“是为人民解除痛苦而来，但全恃本校军队，力量太小，若无人民援助，仍不足负重大责任”。
周恩来还筹建了一支特种革命队伍——大元帅府铁甲车队。这实际上是中国共产党直接领导下的第一支革命军队。后来，这支队伍扩建成为国民革命军第四军独立团，成为北伐军的先锋。
1925年，革命军进行了两次东征，周恩来都是政治部的领导人。他规定了“不拉夫，不筹饷，不强占民房，不用军用券”等。东征军纪律严明，鸡犬不惊，当时曾有“莫走人家取门板，莫拆民房搬砖石，莫踏禾苗坏田产，莫打民间鸭和鸡”的《爱民歌》。“革命军所到之地，人民乐于贸易，自愿帮助运输并代作侦探工作，所以作战顺利，一战而克服东江，此乃中国军队第一次战时政治工作之成绩。”
在东征中，周恩来不仅取得了政治部工作的实践经验，而且有了军事指挥、后方勤务和地方行政工作的实践。
第一次东征中，他参加了进攻淡水之役。淡水是一个地势险要，易守难攻的城池，陈炯明部约4000人守城。蒋介石、周恩来等听叶剑英汇报了敌情和作成方案，详细商计了攻城计划。2月13日发起攻击，周恩来和各级党代表鼓励学生军奋勇战斗，协同粤军第二师占领了淡水。第二次东征中，周恩来参与指挥了攻打惠州城的战役。在战争的关键时刻，他命令蒋先云组织以共产党员和共青团员为骨干的敢死队强行登城。惠州攻克，取得了这次东征的决定性胜利。接着，他又与何应钦率第一师攻占海丰，同陈炯明部近万人决战于华阳、河婆一带，全歼敌中路主力。陈炯明残部退入福建，东征军入闽追歼，周恩来留在汕头主持后方工作。东征胜利结束后，他受命行政主要职务。他帮助地方建立政党、政权和工会、农会等组织，扩大了军队的群众基础。
在两次东征之间，广州发生了著名的沙基惨案。6月23日，为了声援“五卅”后上海工人的斗争，香港口广州的罢工工人和广州的工人、农民、士兵、学生10万人游行示威，经过沙面租界对岸的沙基村时，遭到英、法等国的武装镇压，死50余人，重伤170亲人。周恩来参加了群众游行队伍，3个人一排行进，机关枪扫射过来，他两边的人都中弹身亡，他得以幸免。这是他回国后领导群众斗争遇到的第一次险情。他总是勇于站在斗争的第一线。
1926年12月，周恩来离开广东到上海，任中共中央组织部秘书和中央军委委员，次年2月，任中共上海区委军委书记。
2月23日，中共中央、中共上海区委举行联席会议，决定成立特别委员会，由陈独秀、罗亦农、赵世炎。何松林（汪寿华）、尹宽、彭述之、周恩来、肖子璋组成；并决定成立以周恩来为首的特别军委，准备进行上海工人第三次武装起义。武装起义发动时，周恩来担任了总指挥。
北洋军阀驻在上海的，是毕庶澄部，约3000人，加上当地警察共5000人左右，兵力不强，军心不稳。这对于举行起义是有利的。陈独秀作为中共中央总书记、特委负责人，对于这次起义是积极的，对组织起义也提出过正确的意见。但是他认为起义是“群众的夺取武装，群众的开代表大会”，不主张组织和训练工人的武装队伍。周恩来不同，他认为敌人部队对我们能起多大作用，这取决于我们对工人的武装程度，取决于工人拥有的力量。他重视“自己的准备”，“纠察队、自卫团都有规定特别工作”，“并加暴动起来夺取武装”。周恩来根据特别军委的讨论，提出了军事工作的纲领性计划，包括建立领导机构，组织武装力量，加强队伍训练，准备武器，搜集情报，并且加强敌军工作，核心是建立一支由中共直接领导的有战斗力的武装队伍，成为武装起义的主力。他们组织了纠察队2300人，赤卫队800多人，特别队数百人。周恩来亲自到各训练地点作政治报告成进行军事训练。
上海工人第三次武装起义在1927年的3月21日发动了，整个行动，由特委会议指挥，紧急时由罗亦农、周恩来、何松林（汪寿华）、陈独秀捐挥。周恩来分工在南市指挥，后来又到闸北前线。他身穿灰布棉袍，头戴鸭舌帽，在总指挥部对着地图同赵世炎边商量，边决定，听取报告，指示行动。经过28小时战斗，攻下北洋军阀在上海的最后一个据点——北火车站。起义取得了胜利，完全是靠有织织的产业工人武装作战，打败了几千反动军警。这是中国工人阶级依靠自己的力量武装起义胜利的光辉一页。
工人起义胜利了，蒋介石等率北伐军进入了上海市，却准备着对起义的工人阶级下毒手。4月11日夜到12日凌晨，他们用阴谋诡计缴了工人纠察队的械，13日，开始了疯狂的屠杀和搜捕。昔日的盟友彻底地露出了反动面目，是一个狠毒凶残的刽子手。大批共产党员和工人群众倒在血泊中，中国共产党的组织被迫转入地下。周恩来起草了电报，与赵世炎、罗亦农、陈延年、李立三、尹宽联名致中共中央，主张迅速出师讨伐蒋介石。电报中分析了军事力量对比，认为蒋介石处于不利地位。“为全局计，政治不宜再缓和妥协”。但这一建议未为苏联顾问鲍罗廷和陈独秀所采纳。
1927年5月下旬，周恩来由上海秘密到达中共中央所在地武汉。此前，在汉口召开的中共第五次全国代表大会上，周恩来被选为中央委员；在五届一中全会上，又被选为中央政治局委员。25日，中央政治局常委会议决定周恩来任中共中央军事部部长，必要时参加常委会议。29日，中央政治局常委会议决定周恩来代理中央常委职务，参加中央核心领导。从此以后，在长达半个世纪的时间内，周恩来一直是中共中央的主要领导人之一。
周恩来领导军事部后，以聂荣臻、王一飞、颜昌颐、欧阳钦等为助手，进行了对军队的组织、联络，加强了军队的政治工作，向国民革命军中派去朱德、陈毅、刘伯承等不少干部，并负责指导武汉的工人纠察队和湖南、广东的农民运动。这时，国民革命军独立第十四师师长夏斗寅在宜昌发动的武装叛变虽已击退，长沙许克祥又发动了反革命的“马日事变”，武汉汪精卫叛变革命的迹象越来越明显，周恩来主张在农民运动力量强大的湖南农村发动武装起义。6月17日，他在中共中央常委会上提出，现在湖南18县有8000枝枪，可以派人去集中起来，攻取反动力量弱的城池，计划取湘潭，集中浏阳、平江，省委下设军委，各区设农军委员会，在可能范围内成立乡村的临时委员会，对许多反动军队强则扰之，弱则缴其械。会议同意了这一布置。20日，周恩来在中共中央常委会上又说：湖南省委决定派50人回去，把湖南划为10个区，派10名懂军事的干部去，作好准备，根据政治局决定进行暴动。但这些意见遭到共产国际代表的反对，没有实现，陈独秀在7月5日的中央常委会上甚至说：军事工作应该收缩。
7月15日，汪精卫背叛孙中山的国共合作政策。他同蒋介石一样，对共产党员和革命群众进行大屠杀。
中国共产党决定举行南昌起义。
南昌起义的建议最早是谁提出来的？是周恩来。周恩来讲过这个过程，南昌起义的提出是这样的：“那时，军委想可否搞个起义，主要是鲍罗廷跟加伦说可以搞个起义，国际决定上没有。”而周恩来当时正是军委领导人。这时间是在7月中旬。根据这个考虑，周恩来向在军委工作的几个同志布置，指定贺昌、颜昌颐、聂荣臻组成前敌军委，聂荣臻为书记，任务是先到九江去，通知同志们了解这个意图，作为起义的准备。什么时候发难，要听中央的命令。
7月26日，周恩来由陈赓陪同到九江，27日到南昌。当时，中共临时中央常委会议已经正式决定，成立由周恩来、李立三、恽代英、彭湃组成的中共前敌委员会，周恩来为前委书记，用国民党革命委员会的名义在南昌举行武装起义。
8月1日凌晨，周恩来和贺龙、叶挺、朱德、刘伯承等领导在中国共产党掌握和影响下的国民革命军2万余人举行起义。经过几个小时的激烈战斗，全歼驻南昌国民党军3000余人，于拂晓占领南昌。
南昌起义开始了中国共产党独立地领导革命武装斗争和创建人民革命军队的新时期。从此，8月1日成为中国共产党领导下的革命军队的光荣节日。1933年6月30日，中央革命军事委员会决定以南昌起义的8月1日为中国工农红军成立纪念日，中华苏维埃共和国临时中央政府批准这个决定。中华人民共和国成立后，确定8月1日为建军节。
起义胜利后，周恩来出席在原江西省政府召开的有中国共产党人和国民党左派人士参加的联席会议。会议选出宋庆龄、邓演达、何香凝等25人组成中国国民党革命委员会。周恩来当选为委员，并被任命为参谋团委员。
同日，经周恩来修改定稿的《中央委员宣言》也发布了。宣言指出：“武汉与南京所谓党部政府，皆已成为新军阀之工具，曲解三民主义，毁弃三大政策，为总理之罪人，国民革命之罪人”。宣言提出号召一切革命力量共同努力，为获得一个新根据地，解决土地问题，反对帝国主义、封建势力和一切新旧军阀而斗争。
南昌起义的军事计划，是加伦制定的。当时说是苏联运来一船军人，起义军到汕头一带海口就可取得，因此，军事计划就定在起义军南下广东取得海港，得到苏联军火接济上。8月1日晚，周恩来主持参谋团委员会议，讨论南下行军路线问题。为了避免国民党军队的尾追堵截，尽快与东江农民暴动联络，会议决定选择走国民党兵力较为薄弱的由赣东经寻邬直取东江的行军路线。2日，中共前委对起义部队作了整编，决定沿用国民革命军第二方面军名义，下辖三个军，贺龙代第二方面军总指挥兼第二十军军长，叶挺代前敌总指挥兼代第十一军军长，朱德为第九军副军长。起义军从8月3日起，分批撤离南昌南下。
周恩来于8月5日随革命委员会机关撤离南昌。他的一生，勤勤恳恳，发愤为公，当年就已经如此。29岁的周恩来率领着几万人的起义军，由南昌向南挺进。有战士写道，“每天，当行军休息下来的时候，因为过度疲劳，我们总是一倒地就呼呼入睡。往往一觉醒来睁眼还看见周恩来同志在豆油灯下工作，或者踱着步子，默默沉思。”“我们对待周恩来同志的命令是绝对服从的，从不敢懈怠。这是因为周恩来同志对部下要求非常严格，而他对自己的要求尤其严格。”
12日，起义部队到达宜黄，周恩来同赶到部队来的陈毅谈话，任命他为第十一军第二十五师的主力团——第七十三团的指导员。
8月26日，起义军在瑞金以北的壬田，同布防在瑞金、会昌一线的国民党军钱大钧部两个团遭遇，将其击渍，进占瑞金。在这里，周恩来从报纸上得知各地国民党新军阀封闭工会、农会，捕杀共产党员和工农群众的消息，感到再继续沿用国民党的名义已经不合适。他主持召开中共前敌委员会议，决定要建立无产阶级领导的联合贫苦小资产阶级的工农政权，提出乡村政权应完全归农民，并须以农民为中心，城市政权，工人须占绝对多数。
30日，周恩来和叶挺，刘伯承、聂荣臻等，指挥起义军击溃国民党军钱大钧部九个团，占领会昌。在这里召开的中共前敌委员会议上，决定由福建长汀（汀州）、上杭进入广东东江地区。9月5日．周恩来率起义军到长汀。他主持中共前敌委员会议讨论攻取东江的计划。会上，周恩来和叶挺的主张是：国民党军在潮汕兵力空虚，无险可守，潮汕可以不战而得，因此如果以主力取潮汕然后再折回取兴宁、五华，攻惠州，就过于迂缓，会使国民党军有集中兵力，抢占有利地形攻击起义军的可能，应以主力由三河坝经松口取梅县；再经兴宁、五华取惠州，而以小部兵力，至多两个团趋潮汕。但是，会上多数人和共产国际军事顾问都主张以主力取潮汕，留一部分兵力在三河坝监视梅县方面敌军，再经揭阳出兴宁、五华取惠州，以便得到共产国际接济。后来，就按多数意见作出了决定。这个决定，是遭致后来失败的一个重要因素。
9月10日，周恩来和彭湃率一团起义军占领上杭。19日，占广东大埔县的三河坝。在三河坝，起义军实行分兵，由朱德率第十一军第二十五师和第九军一部留守三河坝，周恩来、贺龙、叶挺、刘伯承等率主力进军潮汕。23日进潮州，24日驻汕头。
在潮汕，起义军因为筹办军饷，延宕到26日才向揭阳集中，而这时，敌人重兵乘起义军进潮汕之机，抢先占领了揭阳、汤坑一带有利阵地。起义军入广东时共有兵力约10700人，这时二十五师约3000人留在三河坝，第二十军第三师约1000人留守潮汕，只有6000亲人的兵力进攻敌人。面对三倍于已的放军，起义军虽然作战勇敢，终因连续苦战，疲惫不堪，未能获胜，而另一路敌军已绕道后背，进占潮州。9月30日晚，周恩来主持召开中共前敌委员会议，决定放弃汕头，向普宁及海陆丰撤退。10月3日，他和贺龙、叶挺等到达普宁县的流沙。周恩来在这里召开了紧急会议，宣布打出苏维埃的旗帜，实行土地革命，决定武装人员去海陆丰帮助农民开展斗争，自己随部队行动；其余领导人分别转往香港或上海。
这时，周恩来正患恶性疟疾，连日发高侥，病势沉重。在当地中共组织的掩护和叶挺、聂荣臻的扶持下，乘小船到了香港治病。起义军余部，在颜昌颐、董朗率领下进入海陆丰地区同当地农军会合，组建为工农革命军第二师。留守三河坝的起义军，在朱德指挥下与国民党军钱大钧部激战后突围转移，然后在朱德、陈毅率领下，转战闽、赣、粤边，到湘南发动了年关起义，扩大衣军队伍达万人，最后上井冈山和毛泽东率领的秋收起义部队会师。
起义军南下虽然失败了，但南昌起义是胜利的。它打响了武装反抗国民党反动派的第一枪，开始了中国共产党领导下武装的革命反对武装的反革命的历史。